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12年、アメリカのユタ州。中世史教授を父に持つ13歳の少年インディ・ジョーンズ（リヴァー・フェニックス）は、砂漠の岩山の下の洞窟で、3人の悪党が宝の十字架を盗もうとしているのを目撃し、それを奪い逃亡するが、結局悪党一味に丸め込まれてしまい、彼の知恵と勇気をほめる悪党の1人からカウボーイ・ハットを受け取るのだった……。それから26年後の38年、ニューヨーク大学の考古学教授で冒険好きのインディ（ハリソン・フォード）はある日、富豪ウォルター・ドノヴァン（ジュリアン・グローヴァー）のペントハウスに連れてゆかれ、責任者の失踪によって頓挫している、磔にされたキリストの血を受けた聖杯の発見を依頼される。はじめ渋るインディは、行方不明になったのが父ヘンリー（ショーン・コネリー）であることを知り、それを引き受けた。ところが友人で父の旧友の考古学博物館長マーカス・ブロディ（デンホルム・エリオット）と共に父の家に向かったインディは、家が何者かによって荒らされている事に、その理由は父から送られてきた聖杯探索の調査記録であることを直感する。インディとマーカスは、ヴェニスで父の同僚シュナイダー博士（アリソン・ドゥーディ）と合流し、古い教会を改装した図書館を訪問、父の聖杯日誌のおかげで地下墓地を発見し、聖杯のありかの手がかりをつかんだ。そしてインディは、悪者の手から聖杯を守るべく活動してきた＜十字剣兄弟団＞のカジムから、父がオーストリアとドイツの国境にあるブルンワルト城に閉じこめられていることを聞いた。シュナイダーと共に城に向かったインディは、ナチも聖杯を探していることを知り、幽閉されていた父との再会もつかの間、シュナイダーの裏切りによってインディ親子は残忍なフォーゲル大佐（マイケル・バーン）の捕虜にされ、聖杯日誌も奪われてしまう。何とか城から脱出したインディとヘンリーは、さまざまなトラブルの末、最後にはフォーゲル大佐との一騎打ちとなり、命からがら勝利を収めるが、聖杯が隠されている＜太陽の神殿＞に向かい、ウォルターやシュナイダーを始めとするナチの探検隊に捕まってしまう。インディは、ウォルターによって腹部を撃たれたヘンリーを助けるために、3つの難関を乗り越え、聖杯を手にするが、その瞬間神殿が崩れ始め、聖杯獲得に色気をみせたシュナイダーは、聖杯と共に神殿の底に沈んでいった。結局聖杯を手にすることはできなかったが、インディとヘンリーは改めて親子の愛情を確認しあうのだった。